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glutathione peroxidase, GSH-Px

點擊次數:388 日期:2019/7/17 15:39:11

                              glutathione peroxidase, GSH-Px

分光光度法 50 /48 

注意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化還原循環中催化還原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px

不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與 ROS 反應,生成氧化型谷胱甘肽 GSSG,從而保護

生物膜免受 ROS 的損害,維持細胞的正常功能;而且具有保護肝臟、提高機體免疫力、拮

抗有害金屬離子對機體的傷害和增加機體抗輻射等能力。

測定原理:

GSH-Px 催化 H2O2 氧化 GSH,產生 GSSG;谷胱甘肽還原酶(GR)催化 NADPH 還原 GSSG,

再生 GSH,同時 NADPH 氧化生成 NADP+;NADPH  340 nm 有特征吸收峰,而 NADP+

沒有;通過測定 340 nm 光吸收減少速率來計算 GSH-Px 活性。

自備儀器和用品:

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配置:

試劑一:液體 100mL×1 瓶,室溫保存。

試劑二:粉劑×1 瓶,4保存。

試劑三:液體 20μL×1 支,-20保存。

混合試劑配制:臨用前,在試劑二中加入試劑一 40 mL,充分震蕩溶解后加入全部試劑三,

混勻。(注意:必須現配現用,當天使用完)

試劑四:液體 5.1mL×1 瓶,4保存。

粗酶液提。

1. 組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,

加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4離心 10min,取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~10001 的比例(建

 500 萬細胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7

秒,總時間 3min);然后 8000g,4,離心 10min,取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體:直接測定。

測定操作:

1. 分光光度計預熱 30 min,調節波長到 340 nm,蒸餾水調零。

2. 混合試劑在 25或者 37(哺乳動物)水浴中預熱 30min。

3. 測定管:依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 試劑四、800μL 預熱的混合試劑、100μL

上清液, 迅速混勻后于 340nm 處測定第 10 s 和第 190s 的吸光值,分別記為 A  1  A 

2,A 測定管= A  1A  2。

計算公式:

(1). 按蛋白濃度計算

GSH-Px 活力單位定義:一定溫度中,每 mg 蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶

活單位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[A 測定管÷ε÷d×V 反總×109Cpr×V 樣)÷T

=536×A 測定管÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

GSH-Px 活力單位定義:一定溫度中,每 g 樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活

單位。

 

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GSH-Px (nmol/min/g)=[A 測定管÷ε÷d×V 反總×109]÷(W×V ÷V 樣總)÷T

=536×A 測定管÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:一定溫度中,每 104 個細胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [A 測定管÷ε÷d×V 反總×109]÷(細胞數量×V ÷V 樣總)÷T

=536×A 測定管÷細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:一定溫度中,每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/mL)=[A 測定管÷ε÷d×V 反總×109]÷V ÷T

=536×A 測定管

εNADPH 摩爾消光系數 6.22×103L/mol/cm;V 反總:反應體系總體積,1000μL=0.001 L;

1061mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);V 樣:加入反應體系中上清液體

積,100μL =0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W,樣本質量,g;T:反應時間,3

min。

注意事項:

1)樣品處理等過程均需要在冰上進行,且須在當日測定酶活力;

2)混合試劑和底物液須臨用前配制,配完后置于冰上,當天使用完;

3)測定過程操作須迅速;

4)細胞中 GSH-Px 活性測定時,細胞數目須在 300 -500 萬之間,細胞中 GSH-Px 的提

取時可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞。

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